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细胞复苏的具体步骤是什么?

发布时间： 2026-08-30　　点击次数： 30次

1前期准备工作

提前开启水浴锅，设置37℃，等待水温稳定。准备培养基、离心管、培养瓶，做好标记。超净工作台开启紫外灭菌30分钟，结束后通风。佩戴手套，从液氮储存环境取出冻存细胞管，取出过程做好防护，防止液氮冻伤。

2快速融化冻存管

将冻存管底部浸入37℃水浴，晃动冻存管加速融化，尽量1‑2分钟内完成融化，管内只剩一点点冰晶即可取出。不要长时间高温水浴，避免细胞长时间处于较高温度，损伤细胞。冻存管管口不要浸入水面，防止水浴液体渗入造成污染。取出之后用75%乙醇擦拭冻存管外壁，带入超净台。

3细胞转移与离心

在超净台内打开冻存管，把细胞悬液缓慢转移至无菌离心管，再加入适量预热完成的培养基，轻轻吹打混匀。设置离心参数，按照细胞对应的转速与时间离心，多数哺乳动物细胞，1000r/min，离心3‑5分钟。离心结束，小心取出离心管。

4弃去冻存液上清

在超净台内吸弃上清液体，上清含有冻存保护剂DMSO，DMSO浓度过高会对细胞产生毒性，需要去除。注意不要吸到底部细胞沉淀，避免细胞损失。

5重悬接种培养

向离心管内加入预热好的新鲜培养基，轻柔吹打，使细胞沉淀充分分散成单细胞悬液。将细胞悬液转移到培养瓶或者培养板中，轻轻摇匀，标记细胞名称、复苏日期。放入培养箱，设置对应温度、二氧化碳浓度进行培养。

6复苏后观察换液

复苏完成24小时之后，显微镜观察细胞贴壁状态、存活情况。根据细胞状态更换新鲜培养基，去除死亡细胞碎片。如果细胞死亡比例很高，可以适当降低接种密度。

7关键注意事项

1，冻存细胞从液氮取出一定要防护，防止冻存管内部残留液氮遇热炸裂。

2，融化速度要快，慢融化会造成细胞内冰晶重结晶，大量细胞死亡。

3，DMSO对细胞有毒，复苏之后需要离心去除；部分耐受细胞方案，也可直接加入培养瓶过夜，第二天换液，该方法只适用于特定细胞。

4，操作全程无菌，所有器皿试剂保证无菌，避免污染。

5，刚复苏细胞状态偏弱，不要立刻传代，待细胞恢复生长、汇合度达标之后再做后续传代实验。

6，如果细胞复苏之后漂浮死亡很多，排查冻存细胞本身状态、融化时间、培养基、培养箱条件。

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